該系統(tǒng)稱為Cascade–Cas3，由進(jìn)行性核酸酶Cas3，以及一個(gè)基于Type IC Cascade的最小系統(tǒng)組成，用于對(duì)細(xì)菌的基因組進(jìn)行編輯。在單一CRISPR RNA的引導(dǎo)下，DNA切割在銅綠假單胞菌中產(chǎn)生了大規(guī)模刪除（7–424千堿基），效率接近100%。

        這項(xiàng)工作由加州大學(xué)舊金山分校（UCSF）的Joseph Bondy-Denomy博士領(lǐng)導(dǎo)，并于10月19日發(fā)表于《自然-方法》雜志，題為“A compact Cascade–Cas3 system for targeted genome engineering”。

        該Cas3系統(tǒng)可用來(lái)切碎Cas9片段，刪除長(zhǎng)段DNA。而且它的精度很高，是少有的高質(zhì)量大規(guī)模編輯工具。Cas3作為這一最小的CRISPR系統(tǒng)的一部分，結(jié)合了準(zhǔn)確性和可變性，已高效地完成了高達(dá)424 kb的基因組刪除。

        在該研究中，科學(xué)家選擇并改良了銅綠假單胞菌所使用的CRISPR-Cas3系統(tǒng)。他們表示，該系統(tǒng)符合“最小”類型IC CRISPR-Cas系統(tǒng)的要求。也就是說(shuō)，它僅利用三個(gè)cas基因（cas5，cas8和cas7）來(lái)產(chǎn)生可組成Cas3的crRNA導(dǎo)向的Cascade監(jiān)視復(fù)合物。

        研究人員將該CRISPR-Cas3系統(tǒng)用于基因組編輯，并評(píng)估了它在銅綠假單胞菌和其他三種微生物中的功能，即大腸桿菌、丁香假單胞菌和肺炎克雷伯菌。他們測(cè)試了三種應(yīng)用：大毒力區(qū)域的一步刪除、多重靶向和質(zhì)粒固化。

        研究人員寫道：“由單個(gè)CRISPR RNA引導(dǎo)的DNA切割在銅綠假單胞菌中產(chǎn)生了大規(guī)模刪除（7–424千堿基），效率接近100％，而相比之下，Cas9則只產(chǎn)生了小規(guī)模的刪除和點(diǎn)突變。Cas3產(chǎn)生了來(lái)自編程位點(diǎn)的雙向缺失，可將銅綠假單胞菌基因組減少837 kb（13.5％）。在使用Cascade-Cas3進(jìn)行編輯時(shí)，同源定向修復(fù)模板可以有效地指定大的缺失邊界，但Cas9沒(méi)有。

        研究人員認(rèn)為，這種源自銅綠假單胞菌的緊湊型CRISPR-Cas3系統(tǒng)，可作為一種新的工具從細(xì)胞基因組中切割出更大的DNA片段，并用于開發(fā)新療法以及研究人類和其他生物的疾病以及正常功能的基因編輯。

        Bondy-Denomy說(shuō)，其他的CRISPR-Cas3系統(tǒng)已經(jīng)在人類和其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞中工作，對(duì)于改良的銅綠假單胞菌系統(tǒng)也應(yīng)該可以實(shí)現(xiàn)。

        眾所周知，CRISPR-Cas9集成體可在目標(biāo)位點(diǎn)快速精確地切除少量DNA。然后可以使用其他方法插入新的DNA。但是，UCSF科學(xué)家采用的新型CRISPR-Cas3系統(tǒng)卻有所不同。該系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶Cas3可快速、準(zhǔn)確地去除更長(zhǎng)的DNA片段。

        Bondy-Denomy解釋說(shuō)：“ Cas3就像帶電動(dòng)機(jī)的Cas9一樣，找到特定的DNA靶標(biāo)后，它就可以在DNA上運(yùn)行并像吃豆人一樣咀嚼它，與Cas9不同的是，當(dāng)Cas3精確地與其DNA靶結(jié)合時(shí)，它開始在兩個(gè)方向上咀嚼雙鏈DNA的一根鏈，從而暴露出一條單鏈。”

        在UCSF實(shí)驗(yàn)中獲得的缺失大小不等，在許多情況下包含多達(dá)100個(gè)細(xì)菌基因。研究人員發(fā)現(xiàn)，CRISPR-Cas3機(jī)制還可使新DNA序列更容易取代缺失的DNA。

該論文的作者補(bǔ)充說(shuō)：“ CRISPR-Cas3是用于真核細(xì)胞的一種特別有前途的工具，因?yàn)樗鼘⒋龠M(jìn)對(duì)大部分非編碼DNA片段的詢問(wèn)，其中大部分功能未知。此外，最近發(fā)現(xiàn)，Cas9產(chǎn)生的'基因敲除'（即，導(dǎo)致插入框外突變的小indels）經(jīng)常編碼可能產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物的假mRNA，因此需要采取全基因去除的方法。”

        根據(jù)Bondy-Denomy的說(shuō)法，沒(méi)有一種簡(jiǎn)單可靠的方法可以刪除細(xì)菌中很大的DNA區(qū)域，并用于研究或治療目的。他建議說(shuō)：“現(xiàn)在，不需要做100個(gè)不同的小DNA缺失。取而代之的是，可以只刪除一個(gè)，然后看看有什么變化。”

        他表示，由于細(xì)菌和其他類型的細(xì)胞通常用于生產(chǎn)基于小分子或蛋白質(zhì)的藥物，因此CRISPR-Cas3將使生物技術(shù)行業(yè)的科學(xué)家能夠更輕松地從這些細(xì)胞中去除潛在的致病性或無(wú)用的DNA。大范圍的細(xì)菌DNA廣為人知，其未知的功能在某些情況下對(duì)于生存是不必要的。此外，細(xì)菌DNA包含從其他來(lái)源導(dǎo)入的大片段DNA，這可能導(dǎo)致細(xì)菌在人的宿主中引起疾病，或轉(zhuǎn)移細(xì)菌的新陳代謝。

        CRISPR-Cas3還可以在工業(yè)、農(nóng)業(yè)甚至人類基因治療應(yīng)用中將整個(gè)基因插入基因組。

        在這項(xiàng)最新的CRISPR-Cas3研究中，通過(guò)操縱提供給細(xì)菌的DNA序列來(lái)修復(fù)缺失，研究人員能夠精確設(shè)置這些大DNA修復(fù)的邊界，而這是CRISPR-Cas9無(wú)法完成的。

        Bondy-Denomy先前發(fā)現(xiàn)了反CRISPR策略，噬菌體進(jìn)化為與細(xì)菌抗?fàn)?，這些策略可能被證明可用于在副作用出現(xiàn)之前阻止用作人類治療劑的Cas酶驅(qū)動(dòng)的基因編輯反應(yīng)，或用于利用噬菌體去除有害細(xì)菌。他說(shuō)，那些填滿了腸道的東西。除了大腸桿菌和其他幾個(gè)物種以外，人們對(duì)那里通常居住的1000多種細(xì)菌物種知之甚少。

        他總結(jié)道：“非模型微生物在遺傳學(xué)世界中已被很大程度上拋在了后面，因此我們非常需要開發(fā)研究它們的新工具。”